黄硕课题组：锥形生物纳米孔道内构建的单原子金反应器

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在科学与应用领域，金借助其特殊的理化性质扮演了不可或缺的角色。首先，金具备极好的延展性、导电导热性与红外反射性等优越的物理性质，因此被广泛的用作材料的镀层或被用作电子器件中的导线与触点。金亦具备独特的化学性质，可用作反应催化剂或新型药物的制备。而在近年来兴起的纳米科学研究中，金被广泛应用于种类繁多的纳米结构和探针的制备。如我们生活中常见的验孕试纸便是使用了胶体形式的金实现检测汇报。金的三价化合物氯金酸不仅是纳米金的制备前体，也是最常见的金化合物，可以和蛋白质乃至核酸碱基产生相互作用。受限于检测仪器的时空分辨率，科研工作者常用的紫外-可见光谱、质谱和核磁等表征手段并不适用于在单分子水平上深入探究包括Au(III)化合物在内的极小分析物与生物大分子之间的动态相互作用。早期研究表明，氯金酸于水中电离产生的四氯化金离子可以抑制细胞膜上水通道蛋白的活性，然而其机理尚未明确（FEBS letters, 2002, 531(3): 443-447）。这就要求我们发展相应的新型分析方法来更加清晰的观测这些现象。

      生物纳米孔技术是近年来发展迅速的单分子研究手段，并已在纳米孔核酸测序领域取得了极为广泛的关注。然而生物纳米孔之所以能够对于核酸上的单个碱基实现分辨，正是源于其超高的动态分辨率，足以分辨小如单个原子的检测分析物。实验中，经过改造的生物纳米孔可以直接被用作纳米反应器，从单分子层面中直接监测化学反应过程。该方向的研究最早可追溯到1997年，英国牛津大学Hagan Bayley课题组通过设计构建工程化溶血素(α-HL)纳米孔，实现了对Zn2+, Cd2+等金属离子与氨基酸残基配位反应的单分子观测(Chemistry & biology, 1997, 4(7): 497-505.)。但是受限于α-HL孔道的直桶圆柱形识别位点与较宽的孔体尺度，所有观测到的信号都表现为极微弱的阻塞信号浮动（2-3 pA）。迄今为止，所有的基于生物孔道的单分子反应器均由溶血素(α-HL)纳米孔构建而成。
       我院化学化工学院黄硕团队在近期研究探索中意外发现Au(III)离子可以通过可逆的Au(III)-硫醚配位作用，与野生型α-HL纳米孔中的甲硫氨酸残基(M113)结合。但正如之前提到的，溶血素对于金属离子的检测信号较小，多元离子[AuCl4]-给出电流阻塞信号也只有5-6 pA，且检测信号具有多种无规则波动，可能来源于Au(III)离子与直筒状识别位点内其它氨基酸（如赖氨酸）的非特异性相互作用所致。受到纳米孔测序技术的启发，黄硕团队通过单个定点突变，将具有锥形识别位点的耻垢分枝杆菌孔蛋白A（MspA）纳米孔内腔中引入了甲硫氨酸，从而将该反应有目的的移植到了MspA纳米孔最尖锐的识别位点，即91号位点处，并观测到了对应的单分子反应信号。
       众所周知，基于生物表达制备的生物纳米孔道只可能形成20种天然氨基酸的空间组合。传统的定点突变工程无法给生物纳米孔到带来任何氨基酸以外的化学性质。而在单个金原子镶嵌孔道内时，MspA纳米孔便具备了单个金原子的化学特性，形成了一个金原子内嵌的黄金生物孔道，从而获得了新的传感功能，并可以直接对多种生物硫醇如L-半胱氨酸(Cysteine, Cys)，L-高半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)和L-谷胱甘肽(Glutathione, GSH)进行单分子区分。生物硫醇分子具有活泼的巯基官能团，可以与[AuCl4]-离子形成更强的Au(III)-硫醇的相互作用，这样，内嵌于孔内的金离子，可以作为一座金原子桥，一端连接纳米孔上的硫醚，一端连接游离的硫醇分子，从而根据其独特的反应中间状态汇报生物硫醇的检测信息。该传感机制简单，无需标记，检测快速且经济高效，有希望设计为便携式传感器芯片用于临床上的检测。并且，Au(III)离子的嵌入可以为其他许多基础科学研究项目提高思路，如启发药物分子靶点的设计，或设计更多的金属内嵌修饰构建一系列金属生物孔道(Metalloporin)来识别其它对应分析物，从而拓宽生物纳米孔的单分子检测功能，并有希望推进基于孔道的单分子蛋白质测序研究。
       该工作以“Giant single molecule chemistry events observed from a tetrachloroaurate(III) embedded Mycobacterium smegmatis porin A nanopore”为题，于2019年12月11日在《Nature Communications》发表相关论文（DOI: 10.1038/s41467-019-13677-2，文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-13677-2）。我院化学化工学院博士生曹姣为该论文第一作者，黄硕教授为该论文通讯作者。此项研究得到了国家自然科学基金（项目编号：91753108、21327902、21675083、31972917）、中央高校基本科研业务费（国际科技合作促进项目）（项目编号： 020514380142、020514380174）、生命分析化学国家重点实验室（项目编号：5431ZZXM1804、5431ZZXM1902）、南京大学卓越计划 (项目编号:ZYJH004)、中组部青年##计划、江苏省高层次创业创新人才引进计划和南京大学科技创新基金项目等经费支持。本工作在发表过程中获得了我院陈洪渊院士、郭子健院士、赵劲教授、朱少林教授与朱从青教授的诸多宝贵意见。

       有机化学中，将包含巯基官能团（-SH）的一类非芳香化合物称为硫醇。从结构上来说，可以看成普通醇中的氧被硫替换之后形成的。除甲硫醇在室温下为气体外，其他硫醇均为液体或固体。低级硫醇一般有难闻的气味，有毒。Thiol-30L 二级精馏聚硫醇巯基化合物，比常规PEMP硫醇更低气味。可应用于在光固化体系能够明显改善低能量固化条件的氧阻聚现象。氧的阻聚主要是由于体系中的自由基和氧气形成了过氧自由基，过氧自由基相对稳定导致链增长反应变缓慢，硫醇中的活泼氢可以和过氧自由基反应，硫醇被夺氢后形成新的自由基，继续参与加成反应。
硫醇可由卤代烷与硫氢化钠起取代反应制得，可作药物、解毒剂和橡胶硫化促进剂。


       黄硕，南京大学教授、博士生导师,2006年于南京大学物理系获得物理学学士学位；2011年于美国亚利桑那州立大学获得生物物理学博士学位； 导师是Stuart Lindsay教授；2011年至2014年在英国牛津大学从事博士后研究工作，导师是Hagan Bayley教授。 2015年7月应聘南京大学化学化工学院教授。现从事主要科研方向为具有仿生学概念的单分子纳米孔生物传感器的 新仪器，新技术的开发。以及基于纳米孔的单分子显微成像技术。其中在纳米孔单分子成像方面具有原创性技术， 具有国际前沿研发水平。目前已于国际权威期刊Nature Nanotechnology, Nano Letters, Journal of Physical Chemistry C, Nanotechnology, Review of Scientific Instrument发表论文9篇。总引用大于500次。 其中以第一作者发表Nature Nanotechnology 2篇，并入选2010年12月刊封面。已授权国际专利两项，并分别 转让Roche,OxfordNanopore Technologies等企业。