季泉江课题组Nature Catalysis：揭示嗜热链球菌Cas9核酸酶催化机制并进化拓展其PAM...

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9月7日，物质学院季泉江课题组与复旦大学甘建华课题组在《自然·催化》(Nature Catalysis)共同发表题为Catalytic-state structure and engineering of Streptococcus thermophilus Cas9 的研究论文，解析了Cas9核酸酶罕见的催化状态结构，揭示了嗜热链球菌Cas9核酸酶（Streptococcus thermophilus Cas9, St1Cas9）的催化机制和PAM DNA识别机制，并基于这些机制进化拓展了St1Cas9 PAM DNA识别，为Cas9核酸酶工作机制的理解和定向进化奠定了重要基础。
      CRISPR/Cas9基因组编辑技术由于简便性和高效性，已经被广泛应用于生物学、医学、农学等领域的基础与应用研究。目前最广泛使用的酿脓链球菌Cas9（Streptococcus pyogenes Cas9, SpCas9），由于脱靶性、细胞毒性、大尺寸（1368个氨基酸）和严格的PAM识别等性质，严重限制了其在疾病治疗等领域的应用。发掘和改造来自不同物种中的Cas9核酸酶是解决目前CRISPR/Cas9技术问题的一种行之有效的方法。St1Cas9是最早发现的Cas9核酸酶之一，具有尺寸小（1121个氨基酸，适用于单个AAV载体组装）、脱靶率低、低细胞毒性等优点，并且近年来报道了其在哺乳动物细胞中具有较高的基因编辑活性，具有潜在的临床应用价值。

图1：HNH核酸酶结构域催化状态结构

       St1Cas9不同于其它Cas9核酸酶的生物化学性质暗示其不同的DNA识别和催化机制。为了阐明St1Cas9的工作机制，研究人员成功解析了St1Cas9-sgRNA-DNA的三元复合物晶体结构，并且意外发现其中的Cas9核酸酶处于DNA切割的催化活性状态，清晰揭示了HNH核酸酶结构域切割DNA靶向链的分子机制(图1)。Cas9的HNH核酸酶结构域具有较高的柔性，因而在目前解析的Cas9复合物结构中，HNH核酸酶结构域大多处于非活性状态。进一步分析发现，St1Cas9具有独一无二的“wing”区域。wing区域主要由两个β折叠组成，通过氢键、盐桥以及范德华力将HNH核酸酶结构域稳定在活性状态，起到调控St1Cas9切割活性以及脱靶活性的作用(图2)。

图2：wing区域的性质与功能

       该研究同时揭示了St1Cas9识别不同PAM DNA的分子机制。不同于目前已有的Cas9家族的PAM识别机制，St1Cas9同时运用氢键和范德华力来识别较为复杂的NNAGAA PAM DNA (N为任意碱基)，丰富了Cas9家族PAM识别机制(图3)。为了拓展St1Cas9 PAM DNA识别，研究人员依据其分子机制进行定向进化，通过引入D939K/E1057L/N1081K/ K1086L这四种氨基酸突变，构建了St1Cas9的KLKL变体，消除St1Cas9对PAM DNA第四号位碱基特异性的相互作用并补以非碱基特异性的相互作用，成功地将St1Cas9的PAM识别范围从野生型的NNAGAA拓展为NNRNAA（N为任意碱基，R为A或G碱基），扩大了St1Cas9的基因编辑范围，使其具有更为广阔的应用前景(图4)。

图3：PAM DNA识别机制

        季泉江课题组博士研究生张翼飞和张洪源分别为论文第一、第二作者，季泉江教授和复旦大学甘建华教授为论文共同通讯作者，上海科技大学iHuman研究所赵素文教授和博士研究生许雪霞参与了此项研究，上海科技大学生命学院黄行许教授为该研究提供了宝贵意见。上海科技大学为第一单位。该研究得到了国家自然科学基金委、科技部、上海市科委和上海科技大学启动经费等项目的支持。

图4：St1Cas9定向进化

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41929-020-00506-9

季泉江

物质科学与技术学院课题组长（PI）、助理教授、研究员

主要研究方向包括：1）CRISPR基因编辑系统的发现、工作机制与定向进化；2）基于CRISPR系统的细菌基因组工程；3）基于CRISPR的耐药细菌感染性疾病治疗手段开发。迄今为止以通讯作者在上述领域在Nature Catalysis, PNAS, JACS, Cell Chemical Biology, PLoS Biology, Chemical Science等期刊发表多篇学术论文。目前课题组包括副研究员1名，博士后2名，博士研究生5名，硕士研究生2名，本科生2名。课题组欢迎对基因编辑和化学生物学感兴趣的学生及科研人员关注和加入。

张翼飞

物质科学与技术学院2016级硕博连读研究生

“科研需要不断探索、发现问题和解决问题。我本科专业是高分子材料加工方向，目前的研究方向是化学生物学，进入了一个完全陌生的领域，但是现在我很庆幸保研选择加入了上海科技大学物质学院和季老师课题组，让我接触到了结构生物学和目前最前沿的CRISPR基因编辑技术，并对基因编辑技术产生了浓厚的兴趣。刚刚读研的时候我对化学生物学的了解就是一张白纸，做实验就像在黑暗中摸索，总是拿不到关键数据，季老师知道我的迷茫，经常和我讨论课题，耐心地教会了我很多知识，实验的师兄们有丰富的科研经验，教会了我如何做实验，所以我非常享受季老师课题组的科研氛围。科研也需要良好的心态。刚刚读研时候的我总是会因为实验的好坏而影响个人情绪，影响实验进度，现在我明白了科研就是不断试错的过程，失败是科研常态，及时找到问题，通过查找文献以及和导师以及有经验的人交流，合理地设计实验解决问题，才能不断地进步。最后，感谢上海科技大学物质学院提供一流的科研环境，以及季老师和课题组同门们在我科研上的帮助！


文章来源：上海科技大学