叶丽丹/于洪巍课题组在维生素E异源生物合成方面取得进展

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维生素E是维持机体正常代谢和机能的必需维生素，包含α、β、γ、δ-生育酚（Tocopherol）和α、β、γ、δ-生育三烯酚（Tocoterienol）共8种化合物（图1）。市面上主要的维生素E产品是化学合成的消旋DL-α-生育酚，以及少量植物提取的天然α-生育酚，前者主要用于动物营养，后者用于膳食补充剂。

图1 维生素E化学结构式

        相比生育酚，生育三烯酚具有更强的抗氧化特性，并且特有降低胆固醇、神经保护和抗癌等生理功能，具备更广阔的应用前景。目前国外已有相应膳食补充剂上市（图2），功效成分主要为植物提取的4种天然生育三烯酚。尽管DL-α-生育酚的化学合成非常成熟，且成本低廉，但生育三烯酚尚未实现商业化的化学合成，并且在植物分布中的相对稀少，限制了其进一步的开发和应用。

图2 国外的天然生育三烯酚膳食补充剂产品

        10月14日，浙江大学叶丽丹/于洪巍课题组在Nature Communications（DOI：10.1038/s41467-020-18958-9）上发表题为“Fermentative production of Vitamin E tocotrienols in Saccharomyces cerevisiae under cold-shock-triggered temperature control”的研究性文章，在酿酒酵母工程菌株中实现了α-生育三烯酚的全生物合成，为发酵法生产该系列产品奠定了重要基础。该文的第一作者为课题组硕士研究生沈斌。

图3 生育三烯酚合成途径及本研究所使用的5个关键基因

       在该研究中，作者在14种光合生物中挖掘并筛选得到了合成生育三烯酚的5个关键基因元件（图3），结合密码子优化和蛋白前导链的精准切除，并结合酿酒酵母内源的莽草酸途径和MVA途径，在非光合生物中成功实现终产物α-生育三烯酚的异源合成。进一步通过确定并解除合成途径的的关键限速步骤，上游途径的综合优化，反馈抑制的解除，代谢平衡的重构等一系列工程菌株的系统改造，最终在摇瓶培养中实现总生育三烯酚产量7.6 mg/g 细胞干重，比初产菌株提高了23.3（图4）。

图4 多策略系统性改造提高酿酒酵母生物合成生育三烯酚

         为了平衡细胞生长与产物合成，作者在基于课题组前期开发的Gal4温敏蛋白Gal4M9基础上，进一步引入层级调控，通过温敏蛋白Gal4M9驱动野生型Gal4的表达（图5）。

图5 冷击调控策略实现生物量及目标产物的分阶段积累

       通过采用新的温控策略，只需若干个小时的冷击，即可触发打开产物合成的开关，相比该课题组之前开发需一直低温维持产物合成的温控诱导系统，升级的系统具有以下优势：1）弥补了Gal4M9的活性损失，根据途径需求定制转录激活蛋白Gal4的表达强度；2）大大降低了工业发酵过程中的能耗成本；3）避免了长期低温对菌株生理代谢变缓的副作用。研究中结合采用新设计的冷击温控系统，成功实现产生育三烯酚工程菌株的细胞生物量积累和目标产物积累的分阶段控制，最后在5 L发酵罐中总生育三烯酚产量达到320 mg/L，为实现天然维生素E的全发酵法生产奠定基础。

图6 冷击调控策略控制基因表达合成天然生育三烯酚

        总体而言，该研究综合了多基因生物合成途径组装、新基因挖掘、蛋白质工程、基因表达控制等手段，最终实现了采用真核底盘合成天然生育三烯酚，在采用合成生物学生产高附加值植物天然产物上又迈进了重要一步。
       在过去的将近十年中，叶丽丹/于洪巍课题组采用酿酒酵母为底盘生物，先后在生物合成途径的组装方式（Decentralized Assembly，Biotechnology and Bioengineering 2014），基因表达顺序调控策略（Sequential control, Metabolic Engineering, 2015），途径组装工具的开发（pMRI、pUMRI系列载体工具），酶工程与代谢工程相结合（Metabolic Engineering，2015；2017），生物合成途径区室化（Nature Communications，2016）, GAL调控系统的改造，首创温敏型GAL4（低温活性型GAL4M9, Biotechnology and Bioengineering, 2018），以及在本研究中继续升级的层级GAL4调控（低温触发型调控）。同时在大宗化学品（异戊二烯），色素系列（番茄红素、β-胡萝卜素、斑蝥黄、虾青素，叶黄素），维生素系列（维生素A、维生素D、维生素E），香精香料（降龙涎香醚）等产品的开发方面不断取得进展，具有很好的工业应用前景。
       该工作得到国家重点研发计划“合成生物学专项”：合成植物天然产物的微生物细胞工厂构建及应用示范（2018YFA0901800）以及国家自然科学基金（LY18B060001 to L. Y. and LZ20B060002 to H. Y.）的支持！


        文章来源：浙江大学
        叶丽丹，博士，浙江大学化学工程与生物工程学院副教授，博士生导师。2004年在浙江大学获得理学学士学位，2006年在浙江大学获得理学硕士学位，2010年在德国耶拿大学获得生物学博士学位, 2010-2013年在新加坡国立大学和新加坡科技研究局从事博士后研究，2013年起在浙江大学工作。主要研究方向是微生物合成生物学，利用代谢工程和蛋白质工程等手段探讨微生物合成过程中的关键问题，已在Metabolic Engineering, Biotechnology and Bioengineering, ACS Synthetic Biology等生物工程领域国际知名刊物发表第一作者/通讯作者SCI论文20余篇。
       于洪巍，浙江大学教授。于1995年获得本科学士学位，1998年获得中国清华大学化学工程硕士学位，2002年获得新加坡国立大学化学工程博士学位，由清智彬教授监督。在新加坡国立大学，南洋理工大学和加利福尼亚理工学院工作后，他回到中国，并于2007年在浙江大学任教。许教授多年研究手性药物分离技术，包括色谱技术（模拟移动床）和外消旋混合物的酶拆分。他的研究兴趣主要集中在通过基因工程改进酶活性和对映体选择性来制备手性化合物。近年来，他的研究兴趣扩大到通过代谢工程生物合成天然产物。