方显杨、李景虹：揭示黄病毒属抗核酸外切酶RNA(xrRNAs)机械稳定性各向异性的分子机制

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近期，清华大学生命学院方显杨课题组与化学系李景虹课题组合作，应用单分子纳米孔技术研究了来源于寨卡病毒的抗核酸外切酶RNA的机械稳定性各向异性现象，并揭示了其机械稳定性各向异性的分子机制。该研究为进一步开发具有机械稳定性各向异性的RNA生物材料提供了依据。
        RNA具有多种重要的生理功能。在生命体内，RNA功能的发挥与其折叠形成的复杂三维空间结构及其稳定性密切相关。在许多生理过程包括蛋白质的翻译、RNA的复制和逆转录等过程中，核糖体、RNA聚合酶或逆转录酶等分子机器方向性地向RNA施加机械力，导致RNA的解折叠或重折叠。例如，在蛋白质翻译过程中，核糖体会从5’到3’方向对模板mRNA施加力，使RNA发生解折叠进而保证翻译的正常进行。RNA对不同方向施加的机械力往往存在响应上的差异，即机械稳定性各向异性(mechanical anisotropy)现象，这一现象在蛋白质和DNA中也普遍存在。RNA的机械稳定性各向异性对于发挥其生理功能以及发展具有可调控机械性能的RNA生物材料具有重要意义。然而，目前人们对RNA如何对机械力做出响应以及RNA机械稳定性各向异性的分子机制知之甚少。

        近年来，人们对一类来源于黄病毒的抗核酸外切酶RNA(xrRNAs)产生了浓厚兴趣。xrRNAs位于黄病毒基因组RNA的3’非翻译区，其形成的独特的环状结构(图1a-b)赋予了其抵抗宿主5’→3’核糖核酸外切酶Xrn1降解的功能，进而导致在被黄病毒感染的宿主细胞中，存在大量的基因组RNA不完全降解而形成的亚基因组RNA (sfRNA)的积累，后者在病毒的致病性和免疫逃逸上发挥重要作用。与此同时，在黄病毒的复制过程中，RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)需要从3’→5’方向解开xrRNAs结构作为合成负链RNA的模板以保证病毒的正常复制。由此人们推测xrRNAs存在机械稳定性各向异性(图1c)，但缺乏实验证据的支持且其中的分子机制尚不清楚。
        为此，方显杨课题组与李景虹课题组合作，应用单分子α-溶血素(α-HL)纳米孔技术、小角X射线散射技术，结合分子动力学计算模拟和酶学降解方法，研究了来源于寨卡病毒的xrRNA1的机械稳定性各向异性现象及其分子机制。α-HL七聚体蛋白镶嵌在磷脂双分子层上形成的纳米孔通道最窄处只有~1.4nm，只允许单链核酸通过，具有复杂高级结构的RNA需要先解折叠成单链才能过孔。通过在RNA的5’或3’端加上单链的引导链，研究在电压驱动下RNA通过纳米孔时的电流变化特征，可以研究RNA沿5’或3’方向的单向解折叠过程(图1d)。相比于光镊、磁镊以及原子力显微镜等多种单分子力谱技术，单分子纳米孔技术在研究生物大分子的机械稳定性各向异性上具有独特优势，前者这些技术是在RNA两端同时施加机械力进行解折叠，因而不能很好地模拟体内RNA的方向性受力解折叠过程。研究证实寨卡病毒xrRNA1确实存在显著的机械稳定性各向异性，并且发现机械稳定性各向异性高度依赖于能稳定xrRNA1环状结构的镁离子浓度以及关键三级相互作用(图1e-f)。该研究表明xrRNA环状结构可作为潜在的结构元件，构建具有可调控机械稳定性各向异性的RNA生物材料。

图1  黄病毒抗核酸外切酶RNA(xrRNAs)的机械稳定性各向异性及其分子机制

        10月30日，该合作研究以“黄病毒属抗核酸外切酶RNA (xrRNAs)机械稳定性各向异性的分子机制(Molecular mechanisms underlying the mechanical anisotropy of flaviviral exoribonuclease-resistant RNAs (xrRNAs))”为题发表在《自然通讯》(Nature communications)期刊上。
        清华大学生命学院方显杨研究员与化学系李景虹教授为该论文的共同通讯作者。清华大学生命学院2016级直博生牛晓林、化学系2014级直博生刘秋翰和生命学院2017级普博生徐钟河为该论文共同第一作者。生命学院合作交流研究生陈志凤、2018级直博生许凌辉和2017级直博生徐礼磊参与了该研究的部分工作。该研究受到国家自然科学基金委、北京结构生物学高精尖创新中心、清华-北大生命科学联合中心的经费支持。


        文章链接：https://doi.org/10.1038/s41467-020-19260-4

供稿：生命学院

编辑：李华山

审核：吕婷

       文章来源：清华大学

       方显杨，男，中国科学院生物物理研究所博士，美国国立卫生研究院国立癌症研究所 博士后 [1]  ，清华大学生命科学学院教授、博导。实验室主要开展与人类疾病和重大生命过程密切相关的非编码RNA的结构生物学研究，主要利用小角X射线散射(SAXS)、核磁共振(NMR)、X射线晶体学技术，并结合其它生物物理学、生物化学、计算生物学和分子生物学的方法与手段，研究与病毒、癌症、神经退行性疾病密切相关的非编码RNA的结构与功能，及其与其它生物大分子包括蛋白质、DNA、 RNA的相互作用；同时发展基于小角X射线散射技术和其它生物物理手段联用的整合结构生物学(Integrated Structural Biology)新方法。

       李景虹，中国科学院院士，清华大学教授，教育部长江特聘教授，国家杰出青年基金获得者，博士生导师。1996年获中科院长春应用化学研究所分析化学博士学位，1997-2001年在美国伊利偌利大学、加利福利亚大学、克莱姆森大学和Evonyx公司研究与工作，2001年入选中科院“百人计划”，任中科院长春应用化学研究所电分析化学国家重点实验室研究员，2004年至今，在清华大学担任化学系和分析中心教授、博士生导师，主要从事电化学与纳米电分析化学、生物传感与生物分析化学以及单细胞分析化学等领域的教学科研工作，在Nature Nanotech., Nature Protocol, Nature Commun., J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem., Anal. Chem.等学术刊物上发表SCI论文300余篇，论文被引用>39,000次，H-index 104 (Google Scholar）。2015年-2018年连续四年入选汤森路透全球高被引科学家。以第一完成人获国家自然科学奖二等奖、教育部自然科学奖一等奖、中国化学会-巴斯夫青年创新奖、中国分析测试协会科学技术一等奖等。任ACS Sensors, Small Methods (Wiley), Materials Today Adv. (Elsevier), Cur. Anal. Chem.等期刊编委或副主编、英国皇家化学会会士。