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[材料资讯] 邹鹏、陈鹏课题组合作开发出基于“生物正交工程”的远红区膜电位探针

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发表于 2021-4-22 12:21:24 | 显示全部楼层 |阅读模式
作为神经系统信息交流的“通货”,神经电活动是大脑处理复杂信息的物理基础。与膜片钳和微电极阵列记录等基于电极材料的传统电生理技术相比,荧光膜电位成像在时空分辨率、测量通量等方面具有明显的优势。其中,发射波长在远红区(640 nm以上)的荧光探针由于其红移的光谱具有更强组织穿透能力,而且可适于多通路成像观测,因而备受研究人员青睐。然而目前可使用的远红区膜电位探针在亮度和灵敏度方面存在严重缺陷,因此亟需发展适用于记录神经元动作电位的高性能荧光探针。
        2021年4月15日,北京大学化学与分子工程学院邹鹏课题组与陈鹏课题组共同在Nature Chemistry杂志在线发表了他们最新的研究成果“A far-red hybrid voltage indicator enabled by bioorthogonal engineering of rhodopsin on live neurons”。他们综合利用生物正交反应和膜蛋白工程化改造策略,开发出一系列具有高灵敏度和成像信噪比的荧光膜电位探针HVI(hybrid voltage indicator)。根据成像光谱需求,HVI的蛋白质骨架可借助生物正交反应搭配不同化学结构的荧光染料,构建出一系列跨越可见光谱的复合型探针。其中,橙红区探针HVI-Cy3具有最高的灵敏度,能够以高达90的信噪比成像记录神经动作电位;远红区探针HVI-Cy5具有最红移的光谱,不仅可与绿色或红色荧光探针同时使用,实现膜电位与钙离子、神经递质等重要生理信号的并行观测,还能够与光遗传学工具联用,实现全光学神经电生理检测。

远红区膜电位探针

远红区膜电位探针
图1 复合型膜电位探针HVI检测神经元膜电位概念图
        邹鹏课题组长期致力于发展和应用化学探针技术,研究参与神经信号转导过程的生物大分子、支配神经活动的化学和物理信号。他们率先提出“复合型膜电位探针”的概念,利用化学手段将荧光染料与视紫红质蛋白相偶联,利用后者的电致变色效应实现膜电位成像(Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 3949-3953)。陈鹏课题组长期致力于发展适用于活细胞及活体动物的生物正交反应,并通过遗传编码技术,实现了蛋白质的特异标记、激活与调控(Nat. Chem. Biol. 2016, 12, 129-137)。在最新的研究成果中,两个课题组合作,将化学反应策略与蛋白质骨架改造相结合,对神经元的膜蛋白进行了原位的“生物正交”工程优化。一方面,鉴于目前大多数生物正交反应难以高效地标记膜蛋白,以及点击化学反应(铜催化炔基-叠氮环加成反应)对神经元的毒性,他们改用了生物相容性更好、效率更高的逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应(IEDDA),将高荧光量子产率的远红区染料引入工程改造的视紫红质蛋白的特异位点。另一方面,他们针对视紫红质蛋白Ace2中的关键质子受体氨基酸残基进行突变筛选,最终得到了消除稳态光电流且亮度及灵敏度显著提升的远红区复合型探针HVI-Cy5。当神经元膜电势发生去极化时,质子电化学势的改变促进视黄醛席夫碱的质子化,从而改变视紫红质的吸收光谱,最终通过FRET效应影响其偶联荧光染料的量子产率,导致荧光信号变化(图2)。

远红区膜电位探针

远红区膜电位探针
图2复合型膜电位探针HVI荧光标记方法示意图及探针响应细胞膜电位变化原理图
        实验表明,HVI-Cy5可与光遗传学工具联用(图3)。研究人员用短波长光单向或者双向调控神经元兴奋性,同时在远红区荧光通道记录膜电位变化,扩充了全光学电生理学工具箱(图3a-c)。该技术相比于传统的多电极膜片钳刺激并记录,技术难度明显下降。HVI-Cy5还可以与其他荧光探针进行双色成像,无串扰监测细胞膜电势及钙离子、递质和pH等生理信号(图3d-f)。多色成像将帮助研究者更好地了解膜电位与其他生理信号动态变化的联系和差异。

远红区膜电位探针

远红区膜电位探针
图3具有深红荧光光谱的HVI-Cy5可与光遗传学工具及钙探针联用实现全光学电生理检测
        此外,实验将HVI-Cy5与光遗传学工具分别表达在不同的大鼠海马体神经元中,利用膜电位成像评估APV和NBQX两种药物对神经元突触连接的影响,解析了NMDAR和AMPAR两类谷氨酸受体对突触信号传递的贡献(图4)。未来,HVI-Cy5有望用于在体外筛选作用于受体蛋白的激动剂或拮抗剂。

远红区膜电位探针

远红区膜电位探针
图4 将HVI-Cy5与光遗传学工具分别表达在不同神经元中可以研究药物对神经突触的作用
         总之,本文通过对视紫红质膜蛋白的“生物正交”工程优化,发展了适用于神经元电信号记录的远红区高性能荧光探针HVI-Cy5,实现多色成像和全光学电生理学应用,期待该探针能够帮助研究者解读更加复杂的神经元电生理信号。
        北京大学化学与分子工程学院博士研究生刘书彰、林畅,北大-清华生命联合中心博士毕业生胥永显(现浙江大学医学中心博士后)为该论文的共同第一作者。北京大学化学与分子工程学院邹鹏研究员和陈鹏教授为该论文的共同通讯作者。该工作得到了国家自然科学基金委、科技部、生物有机与分子工程教育部重点实验室、北京分子科学国家研究中心和北大-清华生命科学联合中心的资助。
        原文链接:https://www.nature.com/articles/s41557-021-00641-1


        文章来源:北京大学
        邹鹏博士,北京大学特聘研究员,博士生导师,主要研究方向是发展化学探针技术,为神经科学的研究提供新工具、新方法,实现针对神经系统实时、定量、高时空分辨的观测。我们的研究处于化学、物理学和神经生物学的交叉领域,将综合利用化学生物学、分子生物学、光学等技术获取数据,并通过数学建模对数据进行定量分析。
         陈鹏,北京大学化学与分子工程学院 “百人计划”研究员。2002年本科毕业于北京大学化学与分子工程学院,2007年获得美国芝加哥大学化学博士学位,并随后在Scripps研究所从事博士后工作。2009年回国,现任北京大学化学学院“百人计划”研究员,化学生物学系副主任,合成与功能生物分子中心副主任,北京大学-清华大学生命科学联合中心PI。 在独立工作中以“活细胞水平上的蛋白质化学修饰与调控”为主线,发展了蛋白质活体标记和操控的化学方法,并开展了这些新技术手段在生物体系中的应用。近五年共以通讯作者发表论文30余篇,包括Nature Chemistry 1篇、Nature Chemical Biology 2篇、J. Am. Chem. Soc. 5篇、Angew. Chem. Int. Ed. 3篇、Acc. Chem. Res和Chem. Soc. Rev.各1篇等。部分代表性工作受到了国际同行的广泛关注,并被Nature Asia Pacific, 美国化学会Chemical & Engineering News,英国皇家化学会Chemistry World及Faculty 1000等专业学术媒体做了报道或推荐。此外,作为主编之一编写了国家自然科学基金《化学科学前沿丛书》之《 化学生物学学科前沿与展望》一书,并组织了多次化学生物学领域的专题会议。目前担任《自然》出版集团Scientific Reports杂志的编委。曾获Elizabeth Norton研究奖 (2007),药明康德生命化学研究奖(2011),中国化学会青年化学奖(2012),第十三届中国青年科技奖(2013)等荣誉。2012年获得国家杰出青年科学基金的资助,并入选了中组部首批青年拔尖人才支持计划。

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