吕雪峰、黄雪年等解析抗真菌药物米卡芬净前体合成机制并构建高效细胞工厂

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棘白菌素类抗真菌药物是治疗深部真菌感染的一线临床用药，其中米卡芬净因存在天然磺酰化修饰具有很好的水溶性优势。棘腔孢霉发酵生产的环脂肽类天然产物FR901379是米卡芬净工业生产的前体化合物，其发酵效率低使得米卡芬净生产成本居高不下，限制了米卡芬净的市场应用。解析FR901379生物合成机制，开展工业菌株理性改造是提高生产效率的重要研究方向。近日，青岛能源所吕雪峰团队解析了FR901379的完整生物合成途径和调控机制，尤其是详细阐明了磺酰化形成机制，在此基础上通过代谢工程改造显著提高了工业菌株的发酵性能，并基于磺酰化模块创制了水溶性提高数千倍的新型磺酰化棘白菌素类化合物。相关成果发表于《代谢工程》（Metabolic Engineering,2022）和《微生物细胞工厂》（Microbial Cell Factories,2023）。 　　

　　图1 FR901379合成调控机制解析及其应用

　　研究团队首先对FR901379合成基因簇进行了生物信息学预测，通过基因敲除进行了系统验证并提出FR901379环脂肽骨架的生物合成途径，包括非天然氨基酸底物合成模块、环脂肽骨架组装模块和后修饰模块。但是，在核心基因簇mcf中始终未发现氧磺酰基模块合成基因。研究团队利用HMMER构建隐马尔可夫模型预测同源基因，并结合差异转录组数据筛选可能负责氧磺酰基基团合成的候选基因。体内敲除和体外酶活结果表明氧磺酰化修饰由细胞色素P450酶McfP和磺酰基转移酶McfS在环脂肽后修饰阶段完成的，有意思的是这两个修饰基因独立于环脂肽母核核心基因簇，形成了一个独立的磺酰化基因簇。更重要的，这两个独立基因簇通过簇内转录调控因子McfJ实现了合成过程的跨基因簇协同作用。研究团队前期在土曲霉中也发现了这种跨基因簇协同调控现象，这可能是进化过程中丝状真菌获得复杂化合物合成能力的一种有效方式（Angew Chem Int Ed Engl, 2020, 132:4379-4383）。
　　阐明FR901379生物合成机制后，研究团队针对棘腔孢霉发酵过程中存在产量低、副产物难分离等问题，开展了系统的工业菌株理性改造研究。首先，用强组成型启动子对转录调控因子McfJ进行了过表达，使FR901379合成途径全面上调，摇瓶产量也提高了3倍，达到1.32g/L。为了减少因氧化不充分导致的中间产物积累，对关键的后修饰限速酶McfF和McfH进行过表达，合成途径优化后副产物含量减少80%以上，产量也进一步显著提高，最终在5 L发酵罐中产量达到4.0g/L，高于现有工业水。  
　　磺酰基基团能够增加化合物的水溶性，进而增加药物的生物利用度，为了创制更多的磺酰化棘白菌素类化合物，研究团队将磺酰化模块在抗真菌药物卡泊芬净前体（纽莫康定B0）生产菌株中进行了异源重构，成功获得了氧磺酰化纽莫康定B0，其水溶性提高了4000多倍，该研究为创制更多磺酰化棘白菌素类化合物提供了酶学元件和可行性验证。
　　该研究完整解析了FR901379的生物合成机制，在此基础上对FR901379合成途径的适配性进行了优化并创制了水溶性的新型磺酰化棘白菌素类化合物，为米卡芬净生产工艺提质增效奠定了基础，同时也为药物水溶性提高提供了新思路。
　　微生物制造工程中心吕雪峰研究员和黄雪年研究员为上述两篇论文的共同通讯作者，博士后门萍为论文的第一作者。该研究得到国家重点研发计划青年科学家项目、国家自然科学基金、山东省人才计划等基金的资助。（文/图 黄雪年 门萍）
　　原文链接1：https://doi.org/10.1016/j.ymben.2022.10.006
　　Men, P., Geng, C., Zhang, X., Zhang, W., Xie, L., Feng, D., Du, S., Wang, M., Huang, X*., Lu, X.*, Biosynthesis mechanism, genome mining and artificial construction of echinocandin O-sulfonation. Metab Eng, 2022, 74: 160-167.
　　原文链接2：https://doi.org/10.1186/s12934-023-02050-0
　　Men, P., Zhou,Y., Xie, L., Zhang, X., Zhang, W., Huang, X*., Lu, X.*, Improving the production of the micafungin precursor FR901379 in an industrial production strain. Microb Cell Fact, 2023, 22: 44.


　　已申请专利：
　　（1）吕雪峰，门萍，黄雪年，耿策，谢丽，张璇；对棘白菌素类化合物氧磺酰化的酶及其应用，专利申请号：CN202210570357.8
　　（2）吕雪峰，门萍，黄雪年，谢丽，杜思雨，张璇；氧磺酰化纽莫康定B0及其制备方法和应用，专利申请号：CN202210568966.X
　　（3）吕雪峰，门萍，黄雪年，周宇，谢丽，王敏；一株高产FR901379的菌株及其构建方法与应用，专利申请号：CN202210570355.9
　　（4）吕雪峰，门萍，黄雪年，谢丽，周宇，王敏；高产FR901379的菌株及其构建方法与应用，专利申请号：CN202210570328.1
       文章来源：青岛能源所
        吕雪峰，男，博士，研究员，博士生导师。1974年生于山西临县。现任中国科学院青岛生物能源与过程研究所副所长，中国科学院生物燃料重点实验室主任。 2015年获国家自然科学杰出青年基金资助。专业方向：生物化学与生物工程，主要从事蓝细菌、土曲霉代谢工程与生物合成研究。1997年毕业于山西大学化学系，获学士学位；2005年毕业于美国新墨西哥大学化学与化学生物学系，获博士学位；2005年至2008年，在美国斯坦福大学化学系从事生物工程博士后研究。2008年5月起任中国科学院青岛生物能源与过程研究所研究员，微生物代谢工程团队负责人。历任中国科学院青岛生物能源与过程研究所所长助理、副所长、纪委书记、党委副书记等职务。
        黄雪年，中共党员，博士，研究员。2010年进入中国科学院青岛生物能源与过程研究所工作，现担任微生物制造工程中心丝状真菌合成生物技术研究组组长，主要从事以应用为导向的丝状真菌天然产物合成生物学研究，与鲁抗医药、海正药业、国光生化等国内多家知名企业建立了长期合作关系。作为负责人先后主持承担国家自然科学基金青年基金、大科学装置联合基金等多项政府科研项目，作为负责人或共同负责人主持多项企业技术开发项目，完成技术转让两项，争取企业合作经费1000多万元。在Angewandte Chemie Int Ed、Metabolic Engineering、Chemical Communications等领域知名期刊发表学术论文十余篇，申请中国发明专利20多项，PCT专利1项，授权8项。入选研究所首批“清源学者”青年人才计划，获得中国科学院沈阳分院优秀青年科技人才奖和海正药业创新突破奖。