蛋白质是执行生命功能的基石，组成其多肽的氨基酸多为L型手性构型。手性位点差异所形成的差向异构体与疾病密切相关，也是现今多肽类药物合成中难以检出的杂质。通常液-质联用技术是鉴定分子手性的主要手段，但是该方法仅能区分少数含D型手性氨基酸的多肽差向异构体，其原因是L/D型氨基酸酶的酶切位点比较有限。此外，由于单个位点的氨基酸异构化往往较难改变整个多肽分子的手性特征，圆二色性光学方法也较难识别多肽的差向异构体。纳米孔道电化学技术作为一种无标记、高通量的单分子检测手段，可根据不同待测物分子穿过纳米孔道时产生的阻断电流特性，从而在单分子水平上获得待测物的重要化学信息。然而，实现单个多肽分子中的手性氨基酸序列分辨仍面临巨大挑战。
        针对这一挑战，南京大学龙亿涛/应佚伦团队长期聚焦于纳米孔道内电化学测量传感机制的创新与理解(JACS Au 2021, 1, 7, 967-976; Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 24582; Chem. Sci., 2022, 13, 2456-2461)，与德国Jacobs University合作，利用细菌外膜通道OmpF孔道内天然多肽折叠结构形成“非对称立体限域空间”，在孔道内构建了横向不对称静电场，从而在限域空间内诱导单个多肽分子上每一个氨基酸侧链翻转，形成了可测量的特征离子流电信号，建立了单个多肽分子差向异构体序列分辨新方法。

图1 OmpF纳米孔道的单个多肽传感测量机制。

       进一步，通过分子动力学模拟了OmpF孔道灵敏区横向不对称静电力诱导的氨基酸残基取向变化过程。系列多肽单分子电化学实验表明，这一普适性的测量方法可被应用于分辨手性精氨酸(L/D-Arg)、天冬氨酸(L/D-Asp)，丝氨酸(L/D-Ser)以及非天然氨基酸1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(L/D-Tic)等在多肽中的位置及数量，建立了每一种多肽差向异构体的离子流指纹谱库。为验证方法，在混合体系中定性定量分析了阿尔茨海默症致病β-淀粉样多肽片段及其D-Asp1差向异构体，和缓激肽B2受体艾替班特药物HOE 140及其D-Ser7差向异构体。该纳米孔道单分子电化学方法无需对多肽样品做任何标记等处理，通过肉眼可分辨的电信号即可实时鉴定多肽样品中的低丰度差向异构体，具有极高的手性氨基酸分辨能力及分析效率。

图2 OmpF纳米孔道用于实际样品的定性及定量检测。

        相关成果以“Identification of Single Amino Acid Chiral and Positional Isomers Using an Electrostatically Asymmetric Nanopore”为题，发表于《美国化学会志》(Journal of the American Chemical Society. DOI: 10.1021/jacs.2c03923)文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c03923。南大化学化工学院一年级直博生高凡为论文的共同第一作者，应佚伦教授和模拟计算合作者德国Jacobs University的Mathias Winterhalter教授为论文的通讯作者。系列工作得到国家自然科学基金委优秀青年基金(21922405)、重大项目(22090050)和中德合作交流项目(M-0143)的资助。

纳米孔道电化学是一种非标记、高通量、高分辨的单分子分析方法。生物纳米孔道通过构建与单个分子尺寸相匹配的单个蛋白质分子界面，电化学限域捕获单个分子。由于空间占位效应以及单个分子与孔道之间的相互作用，导致纳米孔道限域空间内离子流量发生改变，通过解析产生的皮安培(pA)级瞬态离子电流信号，从而获取分子个体的种类、结构、动态行为等信息，现已在科学研究、基因检测中得到广泛应用。
       将发展迅速、具有重大推广前景的前沿科学技术及时介绍给本科学生、转化为本科教学内容，保持课程内容先进性是化学化工学院“仪器分析实验”课程建设的一项重要任务。化学化工学院龙亿涛团队努力实践，遵照对教育工作者提出的“以本为本，四个回归”的要求，应佚伦教授、胡正利博士等团队成员结合团队在纳米孔道单分子测量方面所取得的国际先进成果，积极加入到南京大学设立的“科研融合型”高阶综合设计实验课程教改项目研究中。在化学国家级实验教学示范中心张剑荣教授的指导下，和余晓冬副教授、孔璇凤老师紧密合作，依托南京大学化学实验教学中心，通过构建高稳定性生物纳米孔道、发展高抗干扰能力的微弱电流检测装置、建立高重现性实验方法，设计出一套在本科化学实验室可进行单分子分析的实验装置和原理方法，使得本科学生在实验课堂上通过离子流差异性测量即能从混合样品中对具有一个碱基差异的poly(dA)4和poly(dA)5分子进行逐一识别。

图1：纳米孔道单分子电化学测量原理与主要实验步骤

    “仪器分析实验”是化学类专业的核心平台课程，也是南京大学化学实验教学中心为生物、环化、地学及匡亚明基础学院等本科学生开设的基础课之一，包含有基础实验和设计实验两类实验项目。它的基本任务是通过实验培养学生的动手、观察、思考、交流以及团队合作能力。龙亿涛团队基于前沿科研成果，将化学、生物、信息等知识交叉融合，以兴趣为导向，引导并鼓励学生主动学习、灵活思考、打破常规科研视角，激发科研潜能，学生通过自己设计和自主实验，从不同角度建立基础实验教学与科学研究之间的联系，实现了课堂教学与前沿研究并轨。课程把“教、学、行、思、辩“的教学方法应用于学生创新思维培养的教学目标，同时也培养了学生的科研兴趣、知识应用能力和解决问题能力，为学生今后的科研学习和工作打下基础；在自主设计仪器分析实验课程的建设与改革方面，对创新型复合人才培养迈出重要一步。

图2：纳米孔道单分子实验学习与课堂讨论

        该课程项目获得了南京大学“科研融合型”高阶实验课程培育项目经费资助，相关教学成果以“A Course of Hands-on Nanopore Experiments for Undergraduates: Single-Molecule Detection with Portable Electrochemical Instruments”为题，近期发表在美国化学会化学教育杂志《Journal of Chemical Education》上(J. Chem. Educ. 2020, DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jchemed.0c00389)。
       全文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jchemed.0c00389