江正瑾：多功能生物传感器，病菌分离、检测、杀灭“三合一”

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细菌引起的感染是全球性的公众健康威胁，临床上一般需要有针对性地使用抗生素进行治疗，这就要求对病原菌的诊断快速、灵敏且准确。传统的病原菌检测方法包括：标准平板菌落计数、聚合酶链反应和免疫检测（例如酶联免疫吸附试验）等。不过，标准平板菌落计数法操作复杂且耗时，而后两种测试需要昂贵的专用设备，还需进行复杂的样品预处理，抗干扰能力不强。为了解决这些问题，开发分析时间更短、灵敏度和特异性更高的小型化生物传感器就成了研究热点。通过表面增强拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）来检测病原菌，可提供清晰、特异的细菌“指纹图谱”，从而可以轻松地区分复杂样品中不同种类的细菌，实现快速、灵敏和高效的细菌检测。SERS方法中，细菌的选择性捕获通常使用4-巯基苯硼酸（4-MPBA）、抗体、适配体、抗生素等，但它们的特异性、成本、稳定性等都或多或少存在不足。

近日，暨南大学江正瑾教授、周海波副教授和高昊教授等研究者在Chemical Science 杂志报道了一种基于夹心结构的新型生物传感器，通过磁富集和SERS标签同时分离和检测多种细菌病原体。研究团队使用抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP） 修饰的Fe3O4磁性纳米粒子，作为“捕获”探针用于细菌的选择性分离和磁富集。此外，他们使用4-MPBA修饰的银包金-氧化石墨烯（Au@Ag-GO）纳米复合物作为SERS标签，其中4-MPBA既是生物识别分子又是拉曼信号分子，可用作内标（IS）校正SERS强度。实验证明，这种新型生物传感器可成功分离并检测三种病原菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌），每种菌株的最低检测限仅为10 CFU/mL。有意思的是，AMP修饰的Fe3O4磁性纳米粒子具有高抗菌活性和低细胞毒性，可作为血液长期储存中的抗菌剂。更重要的，这种新方法可用于临床患者血液样本的检测，来自39名患者的真实血液样本中97.3%都可被有效分离和检测，只有一名感染大肠杆菌的患者出现了误判。这种多功能“三合一”生物传感器可以同时分离、检测和杀灭细菌，在临床诊断和输血安全保障等领域都有很好的应用前景。

病菌分离、检测、杀灭“三合一”的SERS生物传感器。图片来源：Chem. Sci.

这种新型生物传感器检测细菌的基础是形成“捕获探针/细菌/SERS标签”的夹心结构。AMP（本文用的是“杆菌肽A”）修饰的Fe3O4纳米粒子作为捕获探针首先与含有细菌、血细胞和其他干扰物的样品一起培养，AMP修饰的Fe3O4纳米粒子与细菌特异性结合，并且通过外加磁场将细菌分离出来，而血细胞和其他干扰物都被除去）。随后，添加用4-MPBA修饰的Au@Ag-GO纳米复合物作为SERS标签，其中4-MPBA既是生物识别分子又是拉曼信号分子，SERS标签即与Fe3O4纳米粒子/细菌形成夹心结构。通过磁分离可以进一步收集这种夹心结构，然后进行拉曼光谱分析。在随后的SERS检测中，4-MPBA作为拉曼信号分子可提供强拉曼信号。当细菌结合到SERS标签上时，4-MPBA与不同种类细菌细胞壁之间发生识别相互作用，拉曼“指纹图谱”也会显示出相应的变化，这就可以区分不同种类的细菌。此外，4-MPBA可用作内标（IS）校正SERS强度。如此一来，这种创新性的SERS夹心策略就能够实现对病原菌的高灵敏检测和特异性鉴别。

研究团队制备了杆菌肽A修饰的Fe3O4磁性纳米粒子（捕获探针）和Au@Ag-GO纳米复合物（SERS标签），并进行了相应的表征。研究者随后验证了用捕获探针和SERS标签检测细菌的可能性。在没有大肠杆菌的情况下，只能得到没有拉曼信号的Fe3O4磁性纳米粒子聚集体；而大肠杆菌存在时，可以得到强拉曼信号的“捕获探针/细菌/SERS标签”的夹心结构。这种夹心结构也通过透射电子显微镜（TEM）得到了验证，与细菌的电镜图像差别十分明显。

对于分别含大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的样品，研究者对SERS结果进行了基于算法的判别分析（discriminant analysis，DA），发现不同的细菌具有不同的“指纹图谱”，完全可以进行分类和鉴别。而且，每种菌株的最低检测限仅为10 CFU/mL。与无标记（不含4-MPBA）SERS细菌检测的对比实验结果证明，4-MPBA可用作内标（IS）校正SERS强度，具有高重现性；同时4-MPBA也是拉曼信号分子，可提高检测灵敏度，放大细菌“指纹图谱”之间的差异。

为了验证这种新方法在临床检测上的实用性，研究者从暨南大学第一附属医院获取了39份全血样品并使用这种SERS生物传感器进行测试。实际血液样品复杂的成分并没有对检测结果产生明显的影响，39份样品中有38份的检测结果都与实际结果相符，仅有1份感染大肠杆菌的血样没有被正确检测出，准确率高达97.3%。此外，抗菌活性测试结果和鼠巨噬细胞的细胞毒性测试结果表明，所用的AMP修饰的Fe3O4磁性纳米粒子具有很好的抗菌活性，而且几乎没有观察到细胞毒性，这意味着其可以作为抗菌剂用于血液的长期储存。

暨南大学药学院的研究团队报道了一种基于“捕获探针/细菌/SERS标签”夹心结构的新型生物传感器。AMP功能化的Fe3O4磁性纳米粒子作为捕获探针用于细菌的选择性分离和磁富集，而4-MPBA修饰的银包金-氧化石墨烯（Au@Ag-GO）纳米复合物作为SERS标签。4-MPBA一方面可以识别细菌，一方面可以作为信号分子产生强的拉曼信号，以4-MPBA为内标校正SERS强度，可提高重现性。无论是实验室内模拟样品的测试，还是真实患者血液样品的临床测试，这种生物传感器都能以很高的准确率区分多种病原菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌），菌株的最低浓度仅为10 CFU/mL。此外，AMP修饰的Fe3O4磁性纳米粒子还具有高抗菌活性和低细胞毒性，可作为抗菌剂用于血液长期储存。总之，这种多功能“三合一”生物传感器可以同时分离、检测和杀灭病原菌，很有希望应用于病原菌临床诊断和输血安全保障等领域。