张学记：催化发夹自组装凝胶电泳用于多种microRNA灵敏检测的研究

wangshi

microRNA（miRNA）作为基因表达的重要调节因子，已成为重要的生物标志物之一，用于多种疾病特别是癌症的诊断和预后。近日，张学记、董海峰课题组在生物医学1区杂志《Theranostics》（IF=8.766）上发表论文，报道了一种传统凝胶电泳与催化发夹自组装系统相结合的体系用于miRNA的多元灵敏检测，并不需要在此系统中并没有添加任何的纳米材料或酶进行信号的放大。

miRNA是单链，序列短（大约19-23个核苷酸），内源性，非编码调控RNA，在许多生物过程中都发挥着至关重要的作用。miRNA的异常表达与包括癌症在内的许多疾病密切相关。例如， miRNA-373曾被证实为新型致癌基因，它可以调节肿瘤的细胞周期和肿瘤的转移，而miRNA-21在许多恶性肿瘤，如乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌和神经胶质瘤中高水平表达，另外，过表达的 miRNA-10b，可以促进癌细胞的转移。因此，miRNA已经成为许多癌症早期诊断和预后的生物标志物之一。然而，由于miRNA序列短，家族成员之间的序列相似性高，易降解，丰度低等特性，开发灵敏的miRNA检测方法还具有一定的挑战性。传统的miRNA检测方法如RT-PCR，Northern印迹，微阵列等技术也存在着一定的劣势。因此，发展一种灵敏度高，特异性好，并且简单方便的策略在早期临床诊断中监测miRNA表达水平，甚至同时检测多个miRNA表达水平是非常重要的。

近年来，已经建立许多miRNA的放大检测策略，例如：目的RNA循环，连接酶链反应，滚环扩增反应，等温链置换聚合酶反应和链取代反应等。其中催化发夹自组装作为链取代反应其中的一种特殊反应，它是一个等温反应，在15分钟之内就能完成，而且无需酶的参与，通过热力学驱动的熵增加原理，实现信号的指数放大。通过将催化发夹自组装与其他检测技术如比色法，荧光法，电化学法，化学发光法，拉曼光谱法和表面等离子体共振法相结合，开发不同种类的miRNA分析检测平台。然而，这些检测方法需要纳米颗粒的参与，复杂的荧光标记，冗长的前处理或者需要昂贵的仪器设备。

在此项研究中，研究人员首次将传统的凝胶电泳与催化发夹自组装信号放大系统相结合，设计出一种多元灵敏检测miRNA的体系。根据热力学和动力学参数，研究人员设计了三对发夹检测探针和发夹辅助探针。当有目标miRNA存在的条件下，相应的发夹检测探针的茎部将被打开，并暴露出隐藏的结构域，与之配对的发夹辅助探针然后与暴露的发夹检测探针结构域杂交，基于热力学驱动的熵增加原理，逐渐取代目标miRNA，形成稳定的发夹检测探针/发夹辅助探针复合物。释放出去的miRNA继续下一次循环，产生指数放大的发夹检测探针/发夹辅助探针复合物。通过这种方式，一个拷贝的目标miRNA可以引发许多相应的发夹检测探针/发夹辅助探针复合物的形成，导致显著的信号放大。根据发夹探针的长度，杂交双链复合物在凝胶电泳中具有不同的迁移率，可用于复杂生物样品中的不同miRNA的同时检测。

研究人员首先探究了此系统的灵敏度，相比于不添加发夹辅助探针的非放大凝胶电泳实验的结果，催化发夹自组装凝胶测定的检测限比非放大凝胶实验的检测限大约低5个数量级，同时与其他的催化发夹自组装实验相比较，此方法也存在很大的优势，可检测fM水平的miRNA。接着又探究了此系统的选择性，结果显示该催化发夹自组装凝胶电泳系统对碱基错配序列具有高选择性和优异的分辨能力。最后，研究人员用此体系定量检测细胞提取液中的目标miRNA，而且与传统qRT-PCR测定的结果相比较，此催化发夹自组装凝胶电泳测定法拥有更高的精确度，这表明提出的此方法具有实际的应用前景。

该研究通过结合传统的凝胶电泳和催化发夹自组装放大体系，开发了一种基于催化发夹自组装的凝胶电泳分析方法，用于多种miRNA的灵敏检测。催化发夹自组装凝胶电泳测定法在没有酶参与的条件下对目标miRNA在fM水平进行检测。此方法具有很高的选择性，可以从单碱基错配的miRNA和其家族成员中区分目标miRNA。而且该检测方法在细胞裂解液中检测的结果与传统的qRT-PCR检测结果一致。更重要的是，由于发夹探针长度的不同，催化发夹自组装凝胶电泳测定法可以有效区分，并同时检测来自细胞裂解液或者均质溶液中的多种miRNA。通过合理设计发夹探针，可以很容易地扩展到更多类型的miRNA的检测，这在没有酶参与放大的实际应用中提供了强大的工具。

张学记教授和董海峰教授是文章的共同通讯作者，课题组成员博士生代文浩为文章的第一作者。

参考文献：
1. DongHF, Lei JP, Ding L, Wen YQ, Ju HX, Zhang XJ. MicroRNA: function, detection, andbioanalysis. Chem Rev.2013; 113: 6207-33.

2.CastañedaAD, Brenes NJ, Kondajji A, Crooks RM. Detection of microRNA by electrocatalyticamplification: a general approach for single-particle biosensing. J Am Chem Soc. 2017; 139: 7657-64.

3. DaiW, Dong H, Guo K, Zhang X. Near-infrared triggered strand displacementamplification for MicroRNA quantitative detection in single living cells. Chem Sci.2018, 9, 1753-9.

4.Lee H, Park JE, Nam JM.Bio-barcode gel assay for microRNA. Nature Commun.2014; 5: 7.

原文链接：

http://www.thno.org/v08p2646.htm