何川/贾桂芳课题组报道RNA修饰m6A去甲基酶FTO对多种RNA修饰底物的去甲基分子机理

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北京大学化学院的何川/贾桂芳课题组在Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（PNAS）在线发表了题为 “Structural insights into FTO’s catalytic mechanism for the demethylation of multiple RNA substrates”的研究论文。

      FTO对人体发育至关重要，FTO酶活功能的紊乱会影响发育和多种疾病的发生，包括肥胖和癌症等。N6-甲基腺嘌呤（m6A）作为mRNA上含量最为丰富的甲基化修饰，是首个被报道的FTO去甲基酶活生理底物。之后陆续报道FTO生理底物还包括mRNA上5’帽端后的N6，2'-O-二甲基化腺嘌呤（cap m6Am），snRNA的m6A和m6Am，tRNA的N1-甲基腺嘌呤（m1A），除此之外还有体外活性底物单链DNA上的N6-甲基脱氧腺嘌呤（6mA）和N3-甲基胸腺嘧啶（3mT）与单链RNA上的N3-甲基尿嘧啶（m3U）。FTO如何识别众多的核酸修饰碱基，是否有催化选择性，如何结合多种RNA，FTO为什么对cap m6Am的活性高于单链RNA上的m6A，及FTO为什么对单链RNA或DNA上的m1A没有活性却对tRNA或茎环结构上的m1A有活性？回答这些FTO的酶催化分子机制有待于蛋白-核酸复合物晶体结构的解析。然而FTO蛋白与核酸底物结合力太弱，致使获得FTO蛋白-核酸复合物晶体结构一直是该领域的挑战和难点。

北京大学化学学院何川/贾桂芳课题组巧妙地对FTO蛋白进行氨基酸位点突变有效地提升了FTO与核酸的结合力，同时不破坏FTO的底物口袋和酶活，首次成功获得了FTO-核酸复合物晶体结构（图1）。通过对FTO与6mA修饰的ssDNA复合物结构解析，3mT、m6A、m6Am和m1A核苷分别叠合到FTO-6mA复合物结构比对分析及体内外生化实验，得出如下结论：1）相比3mT或m1A等其他甲基化碱基，FTO更偏爱N6-甲基腺嘌呤碱基。FTO活性口袋中的氨基酸R96和E234特异性与N6-甲基腺嘌呤碱基的嘌呤环形成氢键相互作用，同时多个氨基酸组成一个稳定的疏水腔用于固定N6-甲基朝向反应中心。2）m6A和m6Am拥有相同的N6-甲基腺嘌呤碱基，区别仅在于糖环的2’位的甲基。通过结构分析和体外生化实验发现FTO对相同碱基序列的RNA中的m6A和m6Am具有相同的去甲基活性，表明FTO的去甲基活性主要依赖于活性口袋中与N6-甲基腺嘌呤碱基的识别，微弱的糖环2’位的结构差异并不会造成FTO对m6A和m6Am的活性差异。3）通过结构分析和体外生化实验发现不同的RNA碱基序列和RNA三维结构会影响FTO的去甲基活性，FTO更偏向大的茎环结构。这帮助解释了为什么FTO对cap m6Am的活性高于单链RNA上的m6A，及为什么FTO对单链RNA或DNA上的m1A没有活性却对tRNA或茎环结构上的m1A有活性。该研究工作阐明FTO对不同RNA底物的催化机理，为深入研究FTO生理功能及开发FTO小分子抑制剂／激活剂奠定了基础。

图1  FTO-6mA核酸复合物晶体结构及去甲基酶活分子机制

    上述工作主要由北京大学化学院何川/贾桂芳课题组的博士研究生张笑、魏连环、肖雨和上海交通大学医学院张良课题组的硕士研究生王雨心等合作完成，同时得到了北京大学医学部药学院汤新景课题组的帮助。贾桂芳和张良为共同通讯作者，该研究得到了国家科技部和国家自然科学基金委等经费资助。

相关链接: https://doi.org/10.1073/pnas.1820574116