周俊等：i-DNA研究领域取得新进展

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i-DNA也即i-motif DNA，是1993年发现的一种由富含胞嘧啶序列形成的非典型四链体核酸结构（图1A）。近年来，越来越多的证据表明i-DNA结构在人细胞核中能保持稳定，i-DNA的形成序列在基因组中广泛存在，尤其集中在癌症基因启动子区域。尽管该结构具有维持端粒长度、调节基因转录和翻译等一系列重要的生理功能，且作为一类新型的抗癌靶点得到广泛关注，但实验验证过的i-DNA形成序列至今总数不超过230条。极其有限的实验数据导致当前科学界对i-DNA结构形成的序列多样性缺乏足够的认知，甚至不同实验室发表的数据中出现了相互矛盾的结果。此外，大多数关于i-DNA结构的研究都集中细胞外，这导致科学界缺乏对细胞内/外i-DNA结构性质的统一认识，由此产生疑惑：细胞外的数据能否代表细胞内的性质？

图1.（A）分子内i-DNA三维结构示意图；（B）半质子化胞嘧啶-胞嘧啶碱基对（C·C+）。

        为了厘清序列对i-DNA结构的影响，并探究i-DNA在细胞内/外稳定性，我院Jean-Louis Mergny特聘教授和周俊副教授研究组设计了近300条序列，系统考察了半质子化胞嘧啶-胞嘧啶碱基对（C·C+, 图1B）数量、环状区域的碱基数量和组成、末端序列的位置和碱基组成等对i-DNA热稳定性和pH稳定性的影响。该工作还基于大量的实验数据，通过机器学习首次构建了i-DNA稳定性的数学预测模型。
       研究发现，在一定范围内环状区域的总长度对i-DNA稳定性几乎没有明显影响（图2A）。作为对比，G-四链体稳定性随着环状区域总长度的延长而单调递减。因此，在揭示基因组中搜索i-DNA和G-四链体的形成序列时，尤其要注意环状区域序列对这两种结构的不同影响。同时，当中间环状区域相对较长时，i-DNA的稳定性会更高（图2B），这个结论与该研究组之前关于G-四链体的发现是类似的（Nucleic Acids Res., 2018, 46, 9264-9275）。此外，i-DNA稳定性会随着C·C+碱基对数量增加而增加，但是增加量会逐渐衰减（图2C）。

图2.（A）环状区域总长度,（B）环状区域的相对排列，（C）C·C+碱基对数量对i-DNA稳定性的影响。

        该研究团队还通过对比细胞内外NMR谱图（图3），发现部分i-DNA不仅可以稳定存在于细胞内，其细胞内的稳定性也明显高于其在溶液中的稳定性。细胞内外的i-DNA稳定性表现出高度的一致性，即在溶液中具有较高稳定性的i-DNA，其在细胞内也具有较高的稳定性。

图3. 细胞内NMR测试后的（A）共聚焦显微镜图和（B）双染色FCM分析；（C）溶液与（D）细胞内变温NMR谱图。

         圆二色（CD）和热差谱（TDS）是表征i-DNA结构最常用的两种基本方法。然而长期以来，谱图的解析却缺乏深刻认识。基于实验中获得的大量CD和TDS数据，通过多元数据分析，首次发现C·C+碱基对作为构成i-DNA结构的核心成份决定CD和TDS谱的主要峰形，而环状区域主要影响主峰之间的过渡区域（图4）。

图4. CD谱图的多元数据分析。（A，B）C·C+碱基对数量，（C，D）环状区域总长度，（E，F）中间环状区域长度。

        这项工作使得i-DNA研究序列数量成倍增加，并对i-DNA的光谱特征提供了详尽的理论解释。研究结果以研究全文的形式背对背投稿到Angew. Chem.杂志，得到了多位审稿人的高度评价：“i-motif研究领域最系统的研究，并将有助于解决该领域的多个难题”以及“i-motif研究领域的里程碑”。该工作有助于研究人员深刻理解i-DNA的结构性质，并在此基础上为进一步构建i-DNA数据库、开发基因组层次上的i-DNA信息检索方法，以及合理设计基于i-DNA结构的核酸纳米器件等方面具有实际指导意义。
        该工作由Jean-Louis Mergny教授和周俊副教授发起，细胞内外核磁、机器学习和光谱分析分别得到捷克马萨里克大学Lukáš Trantírek课题组，英国牛津大学Aleksandr B. Sahakyan课题组，意大利那不勒斯大学Antonio Randazzo课题组的大力支持。我院鞠熀先教授参与了课题的讨论并给出了重要的指导。研究工作得到国家自然科学基金、南京大学、中央高校业务经费和生命分析化学国家重点实验室的经费支持。


        论文信息：
        1.       Mingpan Cheng, Dehui Qiu,Liezel Tamon,Eva Ištvánková,Pavlína Víšková,Samir Amrane,Aurore Guédin,Jielin Chen,Laurent Lacroix,Huangxian Ju,Lukáš Trantírek,Aleksandr B. Sahakyan,Jun Zhou, and Jean-Louis Mergny. Thermal and pH stabilities of i-DNA: confronting in vitro experiments with models and in-cell NMR data. Angew. Chem., Int. Ed. 2021, DOI: 10.1002/anie.202016801.
        2.       Nunzia Iaccarino, Mingpan Cheng, Dehui Qiu, Bruno Pagano, Jussara Amato, Anna Di Porzio, Jun Zhou, Antonio Randazzo, and Jean-Louis Mergny, Effects of sequence and base composition on the CD and TDS profiles of i-DNA.Angew. Chem., Int. Ed. 2021, DOI: 10.1002/anie.202016822.


       文章来源：南京大学
       周俊，南京大学副教授。2010年获中国科学院大连化学物理研究所博士学位，师从李灿院士。2011-2014年在法国国家健康与医学研究院/欧洲生物与化学研究所从事博士后研究，期间获得欧盟玛丽居里学者（Marie Curie International Incoming Fellowship, 2011）。2014年4月回国在中国科学院大连化学物理研究所催化基础国家重点实验室工作，任副研究员。2015年8月加入南京大学生命分析国家重点实验室，任副教授。主要研究方向特殊结构的核酸。