张智军课题组在肺纤维化治疗过程中干细胞活体示踪研究方面取得系列进展

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肺纤维化是一种常见的严重慢性进行性肺间质疾病，大部分表现为特发性肺纤维化（IPF），其发病率和死亡率逐年增加，死亡率高于大多数肿瘤，但目前缺乏有效的治疗手段。最近有研究表明，体内移植间充质干细胞可以有效修复该类肺损伤，但具体作用机制尚不清楚，严重限制了其临床应用。针对以上肺纤维化治疗临床难题，中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所张智军团队在国家重点研发计划项目、国家自然科学基金以及中国科学院经费支持下，开展了肺纤维化疾病治疗过程中的移植干细胞示踪及作用机理研究。
　　由于肺部组织的质子密度低等特点，导致磁共振成像（MRI）等技术应用受限，目前临床上常采用电子计算机断层扫描（CT）技术进行诊断。由于CT成像灵敏度较低，常需要利用CT示踪剂对移植干细胞进行标记，实现移植干细胞的体内可视化示踪。金纳米粒子具有较高的X射线吸收性能、良好的生物相容性、容易制备及表面修饰等特点，是进行干细胞标记和CT影像示踪的理想的纳米材料。基于上述考虑，该团队设计、制备了一系列基于金纳米粒子的干细胞示踪剂，考察了其在肺纤维化治疗过程中对移植干细胞示踪行为。首先研究人员设计、合成了聚赖氨酸与牛血清白蛋白共包覆的金基纳米示踪剂。研究发现，该纳米示踪剂具有良好的生物相容性、优异的CT成像能力以及超高的细胞标记效率。将该金纳米示踪剂标记的间充质干细胞注入肺纤维化小鼠肺部，实现了对肺部移植干细胞长达23天的活体示踪（Nanoscale, 2019, 11, 20932-20941）。在此基础上，为了同时考察移植干细胞的体内存活状态，研究人员构建了聚乙二醇（PEG）和穿膜肽（TAT）修饰的金纳米粒子示踪剂，利用其对间充质干细胞进行标记，同时结合荧光素酶报告基因，对肺纤维化小鼠体内移植干细胞进行CT和生物发光（BLI）双模态示踪（图1）。该工作利用Micro-CT影像技术高穿透深度和高空间分辨率的特点，并借助BLI 高灵敏度以及可识别活细胞的优势，实现了肺纤维化治疗中在体移植干细胞的高灵敏度、实时示踪，并初步探讨了干细胞参与肺纤维化治疗的再生机制（Small, 2019, 15, 1904314）。

　　图1. 外源性Au@TAT纳米示踪剂结合内源性RfLuc报告基因双重标记hMSCs，通过CT/BLI双模态示踪移植干细胞在肺纤维化模型鼠体内的分布、迁移、存活。

　　干细胞通过分化或分泌因子对组织器官损伤进行修复是一个长期的过程，因此纳米示踪剂必须具备对其进行长时程CT影像示踪的能力。但干细胞的胞吐作用以及增殖行为往往导致胞内示踪剂的浓度逐渐降低，引起CT信号减弱直至消失，难以实现对干细胞的长时程示踪。鉴于此，研究人员设计、构建了一系列外界刺激响应智能型金纳米粒子示踪剂，有效克服了上述难题。首先通过在Au纳米粒子表面修饰一层温敏性高分子，从而获得了对温度敏感的纳米示踪剂（TRAuNPs）（图2）。在细胞标记温度39°C条件下，TRAuNPs显示出小尺寸和疏水特性，有利于细胞膜的黏附和穿透，从而有效提高了示踪剂的入胞率；而当温度恢复到正常的生理温度（37°C）时，TRAuNPs发生相变，呈现亲水性增强且体积变大，有效地减缓了细胞的胞吐速率，延长了纳米粒子在胞内的滞留时间，从而达到长时程示踪的效果。进一步将该纳米示踪剂标记的干细胞移植到肺纤维化小鼠的肺部，利用高分辨率的CT成像和高灵敏度的BLI成像，实现了对移植干细胞的定位、分布和迁移过程长达10天的活体示踪。（J. Mater. Chem. B, 2021, 9, 2854-2865）。最近该团队对此策略进行了改进，通过在金纳米粒子表面依次修饰pH响应性磺酰胺聚合物PSD和细胞穿膜肽CPP构建了一种pH响应性金纳米粒子示踪剂CPP-PSD@Au。该纳米示踪剂在细胞摄取的过程中经历细胞内的酸性环境（内涵体和溶酶体）时，由于PSD的质子海绵效应导致对CPP的静电吸引减弱，使得纳米示踪剂形成聚集体，从而减缓干细胞对其的外排速度，大大延长了示踪剂对干细胞的标记时间。在此基础上，将CPP-PSD@Au标记的间充质干细胞移植到IPF模型鼠体内，实现了对移植干细胞长达35天的动态CT示踪，并初步考察了肺纤维化治疗过程中干细胞的作用（Small, 2021, 2101861）。该工作发表后Wiley旗下MaterialsView China立即进行了详细报道。  

　　图2. 温敏性金基纳米示踪剂的制备及其对干细胞的标记与示踪示意图。

　　为了克服单一成像模式的自身缺点，获得更互补、更丰富的移植干细胞体内信息，该团队以牛血清白蛋白（BSA）为模板，合成了金/钆纳米簇（Au/GdNC），并用二氧化硅（SiO2）壳层将其包覆，构建了Au/GdNC@SiO2纳米示踪剂，对肺纤维化小鼠体内移植干细胞进行CT/MRI双模态示踪（图3）。结果发现，SiO2壳层的包覆提高了示踪剂在标记干细胞胞内的稳定性，同时减缓了因干细胞分裂而导致的示踪剂不断稀释的效应，进一步改善了干细胞CT和MRI成像性能（ACS Appl. Bio. Mater. 2020, 3, 2489-2498）。在此基础上，该团队还与东南大学医学院巢杰教授团队密切合作，将CT 成像技术与高灵敏度的近红外荧光（NIRF）成像技术结合，实现了移植干细胞长达21天的CT/NIRF双模态影像示踪。同时进一步揭示了在治疗肺纤维化过程中骨髓间充质干细胞通过抑制巨噬细胞活性而对受损肺组织产生抗炎和抗纤维化的作用（J. Mater. Chem. B, 2020, 8, 1713-1727）。

　　图3. Au/GdNC@SiO2纳米示踪剂用于移植间充质干细胞CT/MRI双模态活体示踪示意图。

　　除了一系列金基CT示踪剂外，该团队还与合作者一起设计、构建了聚赖氨酸修饰的近红外长余辉纳米示踪剂，然后将其与荧光素酶报告基因共同标记的干细胞移植入肺纤维化模型鼠体内，实现了对移植干细胞的位置、迁移、分布以及存活状态长达30天的动态精准示踪（Biomater. Sci. 2020, 8, 3095-3105）。
　　该团队在干细胞纳米示踪方面的上述系列研究受到国际同行的关注。最近他们受邀在国际学术期刊View上发表了题为“In vivo CT imaging tracking of stem cells labeled with Au nanoparticles”的研究综述（View, 2021,  20200119），系统介绍了基于金纳米粒子的干细胞示踪剂的理性设计、制备以及体内示踪应用研究进展，讨论并展望了该领域目前存在的主要挑战及未来可能发展方向。


      

       文章来源：苏州纳米所
        张智军，中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所研究员、博士生导师。1984年和1987年在西北大学分获学士和硕士学位。1998年在日本关西学院大学获理学博士。此后曾在北京大学、日本名古屋大学、加拿大国家研究院和McGill大学从事纳米科学研究。2007年底回国加入苏州纳米所。迄今为止在包括Nature Materials，Nano Letters，Advanced Materials及Biomaterials等国际学术刊物发表论文70余篇，引用3400次；获美国专利1项、中国专利6项。曾获苏州市高层次紧缺人才（2008）、苏州工业园区科教领军人才（2011）以及日本学术振兴会Invitation Fellowship（2011）等荣誉。