黄硕课题组开发新型纳米孔DNA损伤测序方法

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DNA在内源性或外源性因素的持续攻击下形成的异常结构被称为DNA损伤。人体中的DNA损伤与衰老、神经退行性疾病、肿瘤等密切相关，绘制DNA损伤在基因组中的分布对于深入解读其致病机制、研究DNA损伤修复耐受性、开发癌症诊疗策略、评估抗肿瘤药物疗效等方面均有着深远意义。然而，目前测序DNA损伤的工具十分匮乏，由于DNA损伤的致突变以及复制阻滞特性，其信息难以通过二代测序技术读取。面对类型多样的DNA损伤，目前仅有极少数的DNA损伤借助二代测序与抗体富集/化学标记相结合的方法实现了测序，且难以避免抗体或化学标记策略特异性不足的问题，从原理上讲，通过二代测序同时表征DNA中不同类型的DNA损伤也是极为困难的。因此，引入新的DNA损伤测序方法对于推动DNA损伤相关的基础研究以及相应疾病诊疗方案的开发而言十分重要。
         纳米孔测序作为第三代单分子测序技术，具有直接测序核酸的技术优势，在直接表征广泛的核酸序列修饰或损伤方面极具潜力。然而，常规的纳米孔测序分析（图1A, Detection mode I）会产生测序错误，如对于目标修饰碱基的分辨率不足或检测受序列环境干扰而产生错读，以及目标碱基过孔速度太快而造成漏检。
         近日，我院黄硕教授课题组在Nano letters上报道了一种新型通过在纳米孔测序中监测聚合酶阻滞动力学的DNA损伤测序方法（图1 A, Detection mode II），利用单分子水平上DNA损伤与聚合酶活性位点间相互作用汇报出的酶阻滞动力学特征，成功实现了三种烷基化试剂诱导形成的致突变性与致癌性DNA碱基损伤O6-羧甲基鸟苷（O6-carboxymethylguanosine，O6-CMG）、O6-甲基鸟苷（O6-methylguanosine，O6-MeG）与无碱基位点（abasic site, AP site）的准确区分（图1B）。并且，该方法也为常规纳米孔测序中出现的测序错误提供了解决方案。

图1. 通过在纳米孔测序中监测聚合酶阻滞动力学区分DNA损伤的概念演示。

         DNA损伤在纳米孔测序中产生了具有高度一致性的聚合酶阻滞信号，表现为两个重复的电流平台之间的持续波动（图2A）。从测序事件中绘制出酶沿DNA模板位置移动的轨迹，揭示了聚合酶在DNA损伤位点发生了阻滞（图2B）。聚合酶阻滞显著延长了DNA损伤通过孔道的总体时间，有助于规避在纳米孔测序中因目标碱基损伤太快通过孔道而产生漏检的测序错误。酶阻滞动力学特征分析结果显示，单分子聚合酶阻滞动力学能为DNA碱基损伤提供可靠的、不易受序列环境干扰的检测指标（图2C-D），不同于受目标修饰碱基周围序列影响而产生测序错误的常规纳米孔测序读取，酶动力学特征可能有助于检测未知序列环境中的DNA损伤或修饰。O6-CMG、O6-MeG和AP site三种DNA损伤能够通过各自的单分子酶阻滞动力学特征实现准确区分（图2E），而标准纳米孔测序会造成O6-MeG的误读，且难以区分O6-CMG和AP site（图3），充分验证了酶阻滞动力学策略用于DNA损伤检测的可行性及检测能力。

-图2. 利用单分子聚合酶阻滞动力学鉴定DNA损伤。  

图3. 利用常规纳米孔测序分析鉴定DNA损伤。

         该工作以“Discrimination between Different DNA Lesions by Monitoring Single-Molecule Polymerase Stalling Kinetics during Nanopore Sequencing”为题，于2022年6月17日发表于《Nano letters》（文章链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.nanolett.2c01833，DOI: 10.1021/acs.nanolett. 2c01833）。我院博士生张金月与硕士生王宇为论文的共同第一作者，我院黄硕教授为论文的通讯作者，陈洪渊院士对该工作做出了重要指导。此项研究得到了生命分析化学国家重点实验室以及南京大学化学和生物医药创新研究院（ChemBIC）的重要支持，与国家自然科学基金（项目编号：31972917，91753108，21675083）、中央高校基本科研业务费资助（项目编号：020514380257，020514380261）、江苏省高层次创业创新人才引进计划（个人、团体计划）、江苏省自然科学基金（项目编号：BK20200009）、南京大学卓越计划（项目编号：ZYJH004）、上海市市级科技重大专项、南京大学生命科学分析化学国家重点实验室（项目编号：5431ZZXM1902）、南京大学科技创新基金资助项目、中国博士后科学基金（项目编号：2021M691508）等经费支持。
         文章来源：南京大学
         黄硕，南京大学教授、博士生导师,2006年于南京大学物理系获得物理学学士学位；2011年于美国亚利桑那州立大学获得生物物理学博士学位； 导师是Stuart Lindsay教授；2011年至2014年在英国牛津大学从事博士后研究工作，导师是Hagan Bayley教授。 2015年7月应聘南京大学化学化工学院教授。现从事主要科研方向为具有仿生学概念的单分子纳米孔生物传感器的 新仪器，新技术的开发。以及基于纳米孔的单分子显微成像技术。其中在纳米孔单分子成像方面具有原创性技术， 具有国际前沿研发水平。目前已于国际权威期刊Nature Nanotechnology, Nano Letters, Journal of Physical Chemistry C, Nanotechnology, Review of Scientific Instrument发表论文9篇。总引用大于500次。 其中以第一作者发表Nature Nanotechnology 2篇，并入选2010年12月刊封面。已授权国际专利两项，并分别 转让Roche,OxfordNanopore Technologies等企业。